超高效液相色谱法

UPLC：
色谱实验室的新高度

超越HPLC

在过去30年间，高效液相色谱法（HPLC）已经成为世界各地实验室应用最广泛的技术之一。这是因为HPLC是一种强大的多用途技术。它的强大体现在其应用范围广泛，覆盖从毛细管级到制备级的各个范围；在相关的检测技术范围内，它是一种多用途技术，能检测多种化合物。从根本上说，目前，HPLC技术的发展方向主要有三个方面：化学、检测器和系统／数据管理。色谱法在这些方面的进展使该技术得到了广泛认可。尽管如此，色谱技术仍有进一步发展的空间。那么，HPLC的未来将是怎样一幅图景？后续有哪些发展成果能扩大和延展这种公认技术的功用？

UPLC^TM的定义

液相色谱法的前沿技术正在研发中。北加利福尼亚大学的J. Jorgensen博士和杨百翰大学的M. Lee博士最近都发表了关于色谱实验室未来分析范围的深刻见解。他们的研究为分离科学描绘了一幅新图景。通过使用比以前小得多颗粒，使分离过程达到了一个新的终点。该方法的基本原理体现在范第姆特方程中。范第姆特方程是一个描述线速度与塔板高度（柱效）关系的经验式。

鉴于颗粒大小是变量之一，因此，它可用来描述各种颗粒大小的理论性能（图1）。从图1可以看出，一旦填料的颗粒大小低于2 μm，色谱技术就能达到一个新水平：不仅柱效更高，而且随着流速的提高不会使柱效降低。

图1：这些范第姆特曲线表明过去30年间颗粒大小的减小过程。理论塔板高度的降低意味着效率的提高。但即使是2.5 μm的颗粒，其效率也会在较高的流速下开始下降，而系统反压则会相应增高。如果使用UPLC^TM技术和2 μm以下的颗粒，那么即使在较高的线速度下，效率也能得以保持。更短色谱柱和／或更高流速的使用加快了分析速度，提高了分辨率和灵敏度，从而使现在有可能充分利用色谱原理进行分离。

沃特世

这就呈现了这样一种情景：峰容量和分离速度均被提高至新的极限。简言之，峰容量被定义为色谱法每单位时间内所能分辨的峰数量。峰容量和分离速度等性能指标得到提高后的色谱法被称为超高效液相色谱法，或UPLC^TM。图2说明了当颗粒大小从5 μm减小至1.7 μm时，增加的峰容量对色谱分离性能的影响。

图2：比较5 μm颗粒与1.7 μm颗粒。峰容量和分辨率显著增加。

速度、灵敏度和分辨率

源于更小颗粒的额外效率可带来更多的明显益处。更短的色谱柱或更高的流速加快了速度，同时小颗粒也提高了分辨率。对于任何给定的分离，都可通过调节这些变量而达到速度和分辨率的最佳组合。图3显示了UPLC与HPLC的速度比较结果。该实验比较了相同分辨率下，3 μm颗粒和1.7 μm颗粒的分离速度；结果表明较小颗粒的分离速度更快。效率的提高还带来了进一步的益处：灵敏度提高。由于分离过程中的区带变窄，因此分析物会更集中在检测点上。当考虑UPLC的仪器设计要求时，将对这一点进行更详细的论述。

应该指出的是：3 μm是15 cm长普通色谱柱颗粒大小的极限。这是在色谱柱达到最佳流速而又不超出市售仪器（使用任何配比的甲醇－水混合溶剂）的压力限制范围的条件下，运行系统所能使用的最小颗粒大小。（注意：迄今为止，用于HPLC的最小颗粒是0.67 μm [3]。）

如上文所述，范第姆特方程式（及其曲线）表明有必要使用2 μm以下的颗粒，以实现柱效的提高。因此，需要能使UPLC构想得以应用于色谱实验室的技术革新²。

图3：顶部的色谱图是分别使用普通（3 μm）HPLC和1.7 μm UPLC得出的5组分混合样品叠加图谱。底部的色谱图是分离过程的前6分钟的展开图，表明UPLC提高了分离速度而又使分辨率保持不变。UPLC的溶剂用量也大幅度减少。

更小的颗粒，更大的峰容量

研制并填充2 μm以下的颗粒至可重现而耐用的色谱柱中本身就是一个挑战。图4显示出了目前实验室常用的5 μm颗粒与建议用于UPLC柱的更小的1.7 μm颗粒的明显差异。目前，非多孔型1.5 μm颗粒已经上市。虽然这类颗粒效率较高，但它们的缺点是表面积较小。表面积小会导致载样量小和保留时间短。为了与HPLC保持相近的保留时间和载样量，UPLC必须使用多孔型颗粒。UPLC需要一种新颖的耐高压多孔型颗粒。填充床的均匀性也是至关重要的；特别是当较短的色谱柱用以保持分辨率的稳定，而同时又要达到加快分离速度的目标时。另一项要求是色谱柱的内表面必须足够光滑，以便于填充较小颗粒。应重新设计色谱柱两端的筛板，使之既能留住小颗粒又能避免堵塞。

图4：为了说明5 μm颗粒和1.7 μm颗粒的显著差异，该扫描电子显微图将两种颗粒与60 μm的人体头发相比较。在测量距离相同时，该头发的直径约等于12个5 μm的颗粒，33个1.7 μm的颗粒。

UPLC系统的设计要求

为了达到颗粒小、峰容量大的分离效果，需要比目前使用的HPLC仪具有更广的压力范围。在能达到最大效率的最佳流速下，对于10 cm长装有1.7 μm颗粒的色谱柱，计算得出的压力降是~15,000 psi。因此，需要一个能在该压力下传送溶剂的泵。另一方面的考虑是在这些条件下，溶剂的可压缩性将会变得显著，特别是在多溶剂和梯度分离条件下。UPLC的溶剂传送系统应不仅仅具有高压泵抽吸功能，同时在等度和梯度分离模式下使用各种溶剂，溶剂传送系统必须能抵消溶剂可压缩性引起的大范围潜在压力波动，以实现平稳而可重现的流体输送。

进样也是很关键。普通进样阀，不论是手动的还是自动的，都不具有极端压力下的耐用功能。进样的可重现性和线性的典型性能标准是分析应用所需要的，但其它特征也是必要的。为保护色谱柱免受极端压力波动的影响，进样过程应尽可能排除脉冲干扰。仪器的系统体积要小，以减小所检测样品可能的区带展宽。在快速进样循环中，UPLC能以最大速度、较大的样品通量进行工作，并可长时间不需人工照看。同时低体积进样量和最小的交叉污染很好匹配了灵敏度的提高。

理论情况下，配备1.7 μm颗粒的UPLC系统能产生半峰宽小于1秒的检测峰。这给UPLC检测带来了挑战。首先，检测器必须具有较高的采样速率，以在检测峰通过时捕捉足够的数据点，从而对分析物的检测峰进行准确而可重现的识别（和积分）。其次，检测器必须有最小的扩散体积，以确保分离效率不降低。检测器的光学部件也必须具有能体现UPLC灵敏度优势的性能指标。从概念上讲，对于不同的检测技术，UPLC检测的灵敏度应是HPLC分离灵敏度的2-3倍（图5）。例如，质谱检测会极大得益于UPLC的性能特征。检测峰浓度的提高以及较低流速（不需分流）下减少的色谱扩散将会促进离子源效率的提高，从而使与UPLC相连的质谱仪的灵敏度至少提高3倍。

图5：在进行高峰容量的色谱分析时，降低分析物的色谱展宽可能有助于提高灵敏度。

全面的系统方法

通过思考色谱过程以及如何将这些原理应用于UPLC后明显发现：除了化学、泵、进样器和检测器之外，还需要对系统进行考虑。系统的体积至关重要。如果要在色谱分析过程中保持UPLC分离的高性能，则UPLC的系统总体积必须大大低于目前的HPLC系统。还有一点也关键：那就是不仅要仔细考虑上文提到的系统部件的性能规范，而且需要仔细考虑连接管和接头配件。为了使UPLC的良好性能得以广泛应用，有必要制定全面的系统方法，其中既包括所需的性能规范，也包括对附件变量的控制。

在色谱实验室可充分发挥UPLC系统的优势，给实验室带来更多益处。用于特征分析的高通量库筛选能以较快的速度或较好的分辨率完成，而这两点都能转变为效率的提高。代谢物的识别和生物分析将得益于速度、分辨率和灵敏度的提高。肽图时间可显著缩短以加快表征过程。对于肽研究而言，UPLC系统得出图谱的峰容量更大，比目前使用的HPLC得出的图谱更精确。稳定性指示方法以及方法的总体开发将会使每次进样得出更多的信息，同时还会缩短分离时间。色谱分离技术的最普遍用途——定量分析可以得到更快的的速度，更好的基线分离，从而将会更容易、更可重现进行定量积分，增加了实验室的生产力和可信度。

UPLC^TM：重新定义色谱实验室

许多科学家曾一度遇到分离障碍，而目前正致力于突破普通HPLC的极限；超高效液相色谱法为扩大和延展这种广泛应用的分离技术提供了可能（图6）。由于UPLC技术能实现提高液相色谱速度、分辨率和灵敏度的承诺，为每次分析提供更多的信息；因此，该技术将会得到实验室的广泛认可。

图6：UPLC呈现出全新的速度、分辨率和灵敏度，将会重新定义色谱实验室。

参考文献

[1] Anton D. Jerkovich, J. Scott Mellors, and James W. Jorgenson, "The Use of Micrometer-Sized Particles in Ultrahigh Pressure Liquid Chromatography," LCGC North America Volume 21, Number 7 (2003).

[2] N. Wu, J.A. Lippert, and M.L. Lee, "Practical Aspects of Ultrahigh Pressure Capillary Liquid Chromatography," J. Chromatogr. 911, 1 (2001).

N. Wu, D.C. Collins, J.A. Lippert, Y. Xiang, and M.L. Lee, "Ultrahigh Pressure LiquidChromatography/Time-of-Flight Mass Spectrometry for Fast Separations," J. Microcol. Sep. 12, 462 (2000).

[3] J. M. Cintron, L. A. Colon, "Organo-silica Nanoparticles Used in Ultrahigh- Pressure Liquid Chromatography," The Analyst, 127 (2002) 701 - 704.