蓝莓因其良好的口感和众多健康益处而被认为是全球最受欢迎的水果之一，其具有潜在的抗癌、抗氧化、抗炎、抗肥胖和抗糖尿病等生物功能，这些功能的发挥与生物活性代谢物密切相关。基因型多样性、环境条件、果实发育阶段以及这些因素之间的相互作用等会影响果实的生物活性化合物和代谢物的自然积累模式，而现有的研究主要集中在少数基因型/品种中的总代谢物含量或目标特异性代谢物分析。
2021年11月，佛罗里达农工大学Protiva Rani Das团队在Food Chemistry（IF 7.514）上发表了题为“Diversity in blueberry genotypes and developmental stages enables discrepancy in the bioactive compounds, metabolites, and cytotoxicity”的文章。该文研究了八个蓝莓品种在三个发育阶段的总代谢物含量、抗氧化性、抗癌活性，并对其中两个差异显著的品种进行了非靶向代谢组分析，筛选出与抗癌潜力相关的生物标志物，为开发具有卓越果实品质和营养价值的新蓝莓种质提供了见解。
2021年11月，佛罗里达农工大学Protiva Rani Das团队在Food Chemistry（IF 7.514）上发表了题为“Diversity in blueberry genotypes and developmental stages enables discrepancy in the bioactive compounds, metabolites, and cytotoxicity”的文章。该文研究了八个蓝莓品种在三个发育阶段的总代谢物含量、抗氧化性、抗癌活性，并对其中两个差异显著的品种进行了非靶向代谢组分析，筛选出与抗癌潜力相关的生物标志物，为开发具有卓越果实品质和营养价值的新蓝莓种质提供了见解。
研究材料
蓝莓果实
技术路线
· 步骤1：不同蓝莓品种在整个发育阶段的总代谢物含量和抗氧化活性研究；
· 步骤2：蓝莓提取物的抗癌活性研究；
· 步骤3：代谢组学分析；
· 步骤4：生物标志物的筛选及其与抗癌活性的相关性研究。
研究结果
1. 不同蓝莓品种在整个发育阶段的总代谢物含量和抗氧化活性研究
通过测定蓝莓果实每个发育阶段（第 I阶段：绿色；第II阶段：转向色素沉着；第III阶段：成熟）的总酚含量（TPC）、总黄酮含量（TFC）、总花青素含量（TAC）、DPPH自由基清除活性和FRAP抗氧化活性，确定蓝莓品种的总代谢物含量和抗氧化活性。结果发现在蓝莓品种之间以及在每个品种的不同发育阶段存在显著差异。如在整个发育阶段，TFC 的积累模式与 TPC 的积累模式相似，即与阶段-II 和-III 相比，大多数品种发育阶段-I具有显著更高的总酚含量和类黄酮含量。与其他品种相比，“Vernon”和“Alapaha” 品种具有更高的TPC 值和TFC 值。而花青素的积累主要发生在成熟期，其中“Vernon”品种的TAC 水平显著高于其他品种。通过 DPPH 和 FRAP 测定确定蓝莓提取物的抗氧化潜力，发现不同品种和不同发育时期的抗氧化活性的差异与总酚和总黄酮含量的变化相关（图1）。
图1 不同蓝莓品种在不同发育阶段的(A)表型、(B) 总酚含量 (TPC)、(C) 总黄酮含量 (TFC)、(D) 总花青素含量 (TAC)、(E) DPPH 自由基清除活性和 (F) FRAP 活性研究
2. 蓝莓提取物的抗癌活性研究
文章测定了不同品种和发育阶段的蓝莓在250、500、750 和 1000 ng/mL 四种不同提取物浓度和24、48 和 72 小时三个培养时间对人肺癌 A549、肝癌HepG2 和结肠癌 Caco-2 细胞系的抗癌活性。结果发现蓝莓提取物显示出抑制所有三种癌细胞群的潜在功效，且提取物的抗癌活性与剂量和培养时间有关。统计分析发现最高的抗癌潜力与“Vernon”、“Alapaha”品种有关。根据代谢物含量和营养价值筛选出最高（“Vernon”）和最低（“Star”）蓝莓品种，进一步研究发现“Vernon”对癌细胞有更强的抗癌活性，且发育阶段-I比阶段-II和-III具有更高的抑制癌细胞生长的潜力。“Vernon”在抑制癌细胞群方面的更高效力可能是由于其具有较高生物活性代谢物含量 (图2)。
文章测定了不同品种和发育阶段的蓝莓在250、500、750 和 1000 ng/mL 四种不同提取物浓度和24、48 和 72 小时三个培养时间对人肺癌 A549、肝癌HepG2 和结肠癌 Caco-2 细胞系的抗癌活性。结果发现蓝莓提取物显示出抑制所有三种癌细胞群的潜在功效，且提取物的抗癌活性与剂量和培养时间有关。统计分析发现最高的抗癌潜力与“Vernon”、“Alapaha”品种有关。根据代谢物含量和营养价值筛选出最高（“Vernon”）和最低（“Star”）蓝莓品种，进一步研究发现“Vernon”对癌细胞有更强的抗癌活性，且发育阶段-I比阶段-II和-III具有更高的抑制癌细胞生长的潜力。“Vernon”在抑制癌细胞群方面的更高效力可能是由于其具有较高生物活性代谢物含量 (图2)。
图2 蓝莓提取物的癌细胞生长抑制活性研究
3. 代谢组学分析
作者基于所有发育阶段的总代谢物含量、抗氧化能力和抗癌活性的研究，选择了两个最具代表性的品种，“Vernon”和“Star”进行非靶向代谢组学检测。共鉴定出 328 种代谢物，主要是有机酸、脂肪酸、类黄酮、类异戊二烯和单糖。基于代谢物集富集分析(MSEA)，发现p值较高的主要化学基团为氨基酸和多肽、脂肪酸和共轭物、三羧酸、有机羧酸等（图3）。PCA 分析表明，蓝莓代谢物的差异主要是由于品种之间的差异，而在较小程度上是由于发育阶段的差异。接着在每个发育阶段的两个品系之间进行火山图分析，以确定蓝莓代谢物的倍数变化差异。发现三种常见代谢物表阿福豆素-3-没食子酸酯、苜蓿酸和柚皮苷在“Vernon”的每个发育阶段都显著上调。此外，在不同发育阶段如山柰酚、十三烷酸、槲皮素3-阿拉伯糖苷等被确定为通常上调的代谢物。相比之下，没食子酸、曲酸、2,5-呋喃二甲酸、5-羟基-2-糠酸等物质是在每个发育阶段发现的常见下调代谢物（图4）。
图3 代谢物集富集分析 (MSEA)
图4 PCA和柱形图分析（展示火山图前20种 FC 代谢物模式）
4. 生物标志物的筛选及其与抗癌活性的相关性研究
通过偏最小二乘判别分析 (PLS-DA)筛选出整个发育阶段总共 17 种蓝莓生物标志物(VIP ≥ 1.0)，包括奎尼酸、甲基琥珀酸、柠檬酸、草乙酸、苹果酸等。进一步将鉴定的生物标志物和抗癌活性进行热图分析，发现蓝莓代谢产物的相对含量和抗癌潜力在不同品种间存在明显的差异，与“Star”相比，“Vernon”品种具有更高的抗癌活性可能是由于其所鉴定的生物标志物含量更高（图5）。作者进一步对 17 种生物标志物的抗癌活性进行了相关性分析，结果筛选出5种具有较高抗癌潜力的代谢物，包括绿原酸、氧代己二酸、奎尼酸、甲基琥珀酸和苹果酸，同时发现“Vernon”品种在每个发育阶段包含的每种生物标志物的相对含量显著较高（图6）。
图5 生物标志物筛选及与抗癌活性的热图展示
图6 生物标志物的筛选及其与抗癌活性的相关性分析
小结
文章对不同品种不同发育阶段的蓝莓果实进行了总代谢物、抗氧化活性、抗癌潜力和非靶代谢组研究，发现蓝莓提取物之间的差异主要来源于品种差异。结果还证实了与发育阶段-II 和-III 相比，发育阶段 I的蓝莓果实含有更高的酚类物质和类黄酮含量以及更高的抗氧化和抗癌活性。多元统计分析确定了五种与抗癌活性呈较高正相关的生物标志物包括奎尼酸、甲基琥珀酸、绿原酸、氧代己二酸和苹果酸。本研究中鉴定的生物标志物及其证明的抗癌活性预计对食品、制药、营养保健品等领域具有重要价值，有望开发具有抗癌潜力的新种质。
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