1.1. 试剂配制

• 凝胶浓度精准匹配：蛋白电泳需根据目标分子量调整分离胶浓度（小分子蛋白选 12%-15%，大分子选 8%-10%），核酸电泳则按片段长度选琼脂糖浓度（100-500bp 用1.5%-2%，1-10kb 用 0.8%-1%），浓度偏高会导致条带拖尾，偏低易使条带扩散。

 万生昊天GSG系列蛋白预制胶迁移率图谱

• 缓冲液现配现用：Tris-甘氨酸缓冲液（蛋白）、TAE/TBE 缓冲液（核酸）需新鲜配制，避免反复冻融导致离子强度变化；核酸电泳缓冲液可加入终浓度 0.5 μg/mL 的 EB 或无毒染料，无需额外染色步骤。

• 样品处理避坑：蛋白样品需加入 loading buffer 后 95℃加热 5-10 分钟变性，冷却后离心再上样（防止样品飘出加样孔）；核酸样品避免反复冻融，可加入 RNA 酶抑制剂防止降解，上样前用 ddH2O 调整浓度至统一梯度。

1.2. 器材检查

• 电泳槽清洗：用去离子水冲洗电极和槽体，去除残留凝胶或缓冲液结晶，避免短路或条带扭曲；

• 凝胶板密封：组装模具时确保密封条紧密贴合，倒入凝胶前先加少量分离胶测试是否漏液，漏液需重新调整模具；

• 电源校准：确认电源正负极连接正确（蛋白电泳上样孔侧为负极，核酸电泳同理），提前设置好电压参数（恒压模式更稳定）。

2.1. 凝胶制备与凝固

• 分离胶与浓缩胶比例：蛋白电泳浓缩胶浓度固定为 4%，高度约 1cm（帮助样品聚焦），分离胶高度根据样品量调整（一般占凝胶板 2/3）；

• 凝胶凝固技巧：倒入凝胶后立即在表面覆盖一层无水乙醇或异丙醇，隔绝空气加速凝固，同时避免胶面出现凹陷，凝固时间至少 30 分钟（室温较低时可放入 37℃恒温箱缩短时间）。

2.2. 上样与电泳参数

• 上样量控制：蛋白电泳每孔上样量 5-20 μg，核酸电泳每孔 10-50 ng，避免上样过多导致条带重叠，过少则无法显色；上样时枪头需插入加样孔底部缓慢推注，避免产生气泡。

• 电压设置：蛋白电泳浓缩胶阶段用 80V，待溴酚蓝进入分离胶后调至 120-150V；核酸电泳恒压 5-10 V/cm（凝胶长度），小分子片段用较高电压（缩短电泳时间），大分子用较低电压（保证分离效果）。

• 电泳终止时机：蛋白电泳待溴酚蓝到达凝胶底部 1cm 处停止，核酸电泳根据 Marker 迁移位置判断（目标条带与 Marker 对应位置一致时终止），避免过度电泳导致条带跑出凝胶。

2.3. 染色与显影优化

• 蛋白染色：考马斯亮蓝染色需用染色液加热至95℃后，摇床脱色 0.5-1小时；脱色液加热至95℃后，摇床脱色 0.5-1小时，根据脱色效果，可重复更换 1-2 次脱色液，可加入少量甘油防止凝胶干裂；银染法灵敏度更高，适合低丰度蛋白，但需严格控制染色和显影时间（避免背景过深）。

• 核酸显影：EB 染色后用紫外凝胶成像仪观察，曝光时间控制在 10-30 秒（避免过度曝光导致条带模糊）；无毒染料（如 GoldView）可在电泳过程中实时观察，无需额外染色步骤，更安全高效。

• “新鲜” 是基础：试剂、样品尽量现配现用，避免长时间存放导致性能下降；

• “匹配” 是关键：凝胶浓度、电压、上样量需根据目标分子大小精准匹配，不可一概而论；

• “耐心” 是保障：凝胶凝固、脱色、显影等步骤需足够时间，避免急于求成导致实验失败。